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Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

University of Leicester

G &#x86CB;&#x767D;&#x5076;&#x8054;&#x53D7;&#x4F53;&#x7684;&#x6D3B;&#x52A8;&#x662F;&#x901A;&#x8FC7;&#x8D85;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x4E0B;&#x5217;&#x6FC0;&#x52A8;&#x5242;&#x523A;&#x6FC0;&#x53D7;&#x89C4;&#x7BA1;&#x3002;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x5728;&#x76D1;&#x7BA1;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x7684;&#x666E;&#x904D;&#x6027;&#x8D28;&#xFF0C;&#x53D7;&#x4F53;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7684;&#x751F;&#x7406;&#x5F71;&#x54CD;&#x4ECD;&#x7136;&#x5F88;&#x5DEE;&#x7814;&#x7A76;&#x3002;&#x4E3A;&#x4E86;&#x89E3;&#x51B3;&#x8FD9;&#x4E00;&#x95EE;&#x9898;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x751F;&#x6210;&#x8868;&#x793A; M (3) &#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7F3A;&#x5931;&#x682A;&#x7684;&#x6572;&#x95E8;&#x58F0;&#x4E2D;&#x9F20;&#x6807;&#x5E94;&#x53D8;-&#x6BD2;&#x8548;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53;&#x3001; &#x539F;&#x578B; G(q/11) &#x8026;&#x5408;&#x53D7;&#x4F53;&#x3002;&#x6B64;&#x7A81;&#x53D8;&#x5C0F;&#x9F20;&#x54C1;&#x7CFB;&#x6B64;&#x5904;&#x7528;&#x4E8E;&#x8C03;&#x67E5;&#x7684; M (3) &#x4F5C;&#x7528;-&#x6BD2;&#x8548;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x8C03;&#x8282;&#x7684;&#x4ECE;&#x80F0;&#x5C9B;&#x5206;&#x6CCC;&#x80F0;&#x5C9B;&#x7D20;&#x3002;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x4E0D;&#x8DB3;&#x53D7;&#x4F53;&#x8026;&#x5408;&#x5230; G(q/11) &#x4FE1;&#x53F7;&#x901A;&#x8DEF;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4ECE;&#x4F9D;&#x8D56;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x7684;&#x8FDB;&#x7A0B;&#xFF0C;&#x4F8B;&#x5982;&#x53D7;&#x4F53;&#x5185;&#x90E8;&#x5316;&#x548C; &beta;-arrestin &#x62DB;&#x8058;&#x89E3;&#x8026;&#x3002;&#x6572;&#x95E8;&#x58F0;&#x5728;&#x5C0F;&#x9F20;&#x663E;&#x793A;&#x53D7;&#x635F;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x8010;&#x91CF;&#x53CA;&#x80F0;&#x5C9B;&#x7D20;&#x5206;&#x6CCC;&#xFF0C;&#x8868;&#x660E; M (3)-&#x8868;&#x793A;&#x5BF9;&#x80F0;&#x5C9B;&#x7684;&#x6BD2;&#x8548;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53;&#x8C03;&#x8282;&#x8461;&#x8404;&#x7CD6;&#x7A33;&#x6001;&#x901A;&#x8FC7;&#x53D7;&#x4F53;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;-/ arrestin &#x4F9D;&#x8D56;&#x7684;&#x4FE1;&#x53F7;&#x3002;&#x673A;&#x5236;&#x5BF9;&#x6D3B;&#x5316;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x9176; D1&#xFF0C;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x8BBE;&#x6709;&#x4E0B;&#x6E38;&#x7684;&#x62DB;&#x52DF;&#x5230;&#x78F7;&#x9178;&#x5316; M (3) &beta;-arrestin-&#x6BD2;&#x8548;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x652F;&#x6301;&#x72EC;&#x7279;&#x7684;&#x6982;&#x5FF5; (3) M-&#x6301;&#x7EED;&#x7684;&#x80F0;&#x5C9B;&#x7D20;&#x91CA;&#x653E;&#x6BD2;&#x8548;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x589E;&#x52A0;&#x5F88;&#x5927;&#x7A0B;&#x5EA6;&#x4E0A;&#x72EC;&#x7ACB;&#x4E8E; G &#x86CB;&#x767D;&#x5076;&#x8054;&#xFF0C;&#x4F46;&#x6D89;&#x53CA;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;-/ arrestin &#x4F9D;&#x8D56;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x9176; D1 &#x53D7;&#x4F53;&#x7684;&#x8026;&#x5408;&#x3002;

M3 &#x6BD2;&#x8548;&#x78B1;&#x53D7;&#x4F53;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x80F0;&#x5C9B;&#x7D20;&#x91CA;&#x653E;&#x901A;&#x8FC7;&#x86CB;&#x767D;&#x6FC0;&#x9176; D1 &#x53D7;&#x4F53;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;/arrestin &#x4F9D;&#x8D56;&#x7684;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x3002;

The activity of G protein-coupled receptors is regulated via hyper-phosphorylation following agonist stimulation. Despite the universal nature of this regulatory process, the physiological impact of receptor phosphorylation remains poorly studied. To address this question, we have generated a knock-in mouse strain that expresses a phosphorylation-deficient mutant of the M(3)-muscarinic receptor, a prototypical G(q/11)-coupled receptor. This mutant mouse strain was used here to investigate the role of M(3)-muscarinic receptor phosphorylation in the regulation of insulin secretion from pancreatic islets. Importantly, the phosphorylation deficient receptor coupled to G(q/11)-signaling pathways but was uncoupled from phosphorylation-dependent processes, such as receptor internalization and Î²-arrestin recruitment. The knock-in mice showed impaired glucose tolerance and insulin secretion, indicating that M(3)-muscarinic receptors expressed on pancreatic islets regulate glucose homeostasis via receptor phosphorylation-/arrestin-dependent signaling. The mechanism centers on the activation of protein kinase D1, which operates downstream of the recruitment of Î²-arrestin to the phosphorylated M(3)-muscarinic receptor. In conclusion, our findings support the unique concept that M(3)-muscarinic receptor-mediated augmentation of sustained insulin release is largely independent of G protein-coupling but involves phosphorylation-/arrestin-dependent coupling of the receptor to protein kinase D1.

M3-muscarinic receptor promotes insulin release via receptor phosphorylation/arrestin-dependent activation of protein kinase D1.

L&#39;activit&eacute; de G protein-coupled receptors est r&eacute;gl&eacute;e par l&#39;interm&eacute;diaire d&#39;apr&egrave;s la stimulation agoniste hyper-phosphorylation. Malgr&eacute; le caract&egrave;re universel de ce processus de r&eacute;glementation, l&#39;impact physiologique de la phosphorylation du r&eacute;cepteur reste mal &eacute;tudi&eacute;. Pour r&eacute;pondre &agrave; cette question, nous avons g&eacute;n&eacute;r&eacute; une souche de souris knock-in qui exprime un mutant de phosphorylation d&eacute;ficient de la M (3)-r&eacute;cepteurs muscariniques, un prototype r&eacute;cepteur coupl&eacute; aux G(q/11). Cette souche de souris mutante a &eacute;t&eacute; utilis&eacute;e ici pour &eacute;tudier le r&ocirc;le de M (3)-la phosphorylation du r&eacute;cepteur muscarinique dans la r&eacute;gulation de la s&eacute;cr&eacute;tion d&#39;insuline des &icirc;lots pancr&eacute;atiques. Important, le r&eacute;cepteur d&eacute;ficient de phosphorylation coupl&eacute;e &agrave; des voies de signalisation de G(q/11) mais a &eacute;t&eacute; d&eacute;coupl&eacute; de processus de phosphorylation d&eacute;pendants, tels que l&#39;internalisation du r&eacute;cepteur et de la &beta;-arrestine recrutement. Les souris knock-in a montr&eacute; avec facult&eacute;s affaiblies de la s&eacute;cr&eacute;tion d&#39;insuline et de la tol&eacute;rance glucose, indiquant que M (3) - r&eacute;cepteurs muscariniques exprim&eacute;es sur les &icirc;lots pancr&eacute;atiques r&eacute;gulent l&#39;hom&eacute;ostasie du glucose par l&#39;interm&eacute;diaire de la phosphorylation du r&eacute;cepteur- / arrestine-d&eacute;pendante de signalisation. Les centres de m&eacute;canisme sur l&#39;activation de la prot&eacute;ine kinase D1, qui op&egrave;re en aval du recrutement de la &beta;-arrestine aux M phosphoryl&eacute;e (3)-r&eacute;cepteur muscarinique. En conclusion, nos r&eacute;sultats appuient le concept unique que M (3) - augmentation de m&eacute;di&eacute;e par les r&eacute;cepteurs muscarinique de la lib&eacute;ration d&#39;insuline soutenue est largement ind&eacute;pendante de la prot&eacute;ine G raccord mais implique la phosphorylation- / couplage du r&eacute;cepteur de prot&eacute;ine kinase D1 arrestine-d&eacute;pendante.

R&eacute;cepteur muscarinique M3 favorise la lib&eacute;ration d&#39;insuline par l&#39;interm&eacute;diaire de l&#39;activation du r&eacute;cepteur &Eacute;PC-arrestine-phosphorylation de la prot&eacute;ine kinase D1.

Die Aktivit&auml;t von G-Protein-gekoppelter Rezeptoren ist &uuml;ber hyper-Phosphorylierung folgende Agonist Stimulierung reguliert. Trotz der universellen Natur dieser Regulierungsprozess bleibt die physiologische Auswirkungen der Rezeptor Phosphorylierung schlecht studierte. Um diese Frage zu l&ouml;sen, haben wir einen Knock-in Maus-Stamm, der eine Phosphorylierung-defizienten Mutante des M (3) dr&uuml;ckt erzeugt-muskarinische Rezeptoren, ein prototypisches G(q/11)-gekoppelter Rezeptor. Diese mutierte Maus-Sorte wurde hier verwendet, um die Rolle von M (3) untersuchen-muskarinische Rezeptoren Phosphorylierung bei der Regulierung der Insulin-Sekretion von Pankreas Inselchen. Wichtig ist, der Phosphorylierung mangelhaft Rezeptor gekoppelt mit G(q/11)-Signalisierung Wege aber war abgekoppelt von Phosphorylierung-abh&auml;ngige Prozesse wie Rezeptor Internalisierung und &beta;-arrestin Rekrutierung. Die Knock-in-M&auml;use zeigte beeintr&auml;chtigt Glukose Toleranz und Insulin-Sekretion, der angibt, dass M (3) - muskarinische Rezeptoren auf Pankreas Inselchen ausgedr&uuml;ckt regulieren Glukose Hom&ouml;ostase &uuml;ber Rezeptor-Phosphorylierung- / arrestin-abh&auml;ngige zu signalisieren. Die Mechanismus-Centers auf der Aktivierung der Proteinkinase D1, die stromabw&auml;rts betreibt der Rekrutierung von &beta;-arrestin phosphorylierten m (3)-muskarinische Rezeptoren. Abschlie&szlig;end unsere Erkenntnisse unterst&uuml;tzen das einzigartige Konzept, dass M (3) - muskarinische Rezeptoren vermittelt Vermehrung des anhaltend Insulin-Freisetzung besteht weitgehend unabh&auml;ngig von G-Protein-Kupplung sondern Phosphorylierung- / arrestin-abh&auml;ngige Ankopplung von der Proteinkinase D1-Rezeptor.

M3-muskarinische Rezeptoren f&ouml;rdert Insulin-Freisetzung &uuml;ber-Phosphorylierung/arrestin-abh&auml;ngige Aktivierung der Proteinkinase D1.

L&#39;attivit&agrave; dei recettori accoppiati a proteine G &egrave; regolata tramite stimolazione agonista seguito iper-fosforilazione. Nonostante la natura universale di questo processo normativo, l&#39;impatto fisiologico di fosforilazione del recettore rimane scarsamente studiato. Per rispondere a questa domanda, noi abbiamo generato un ceppo di topo knock-in che esprime un mutante di fosforilazione-carenti di M (3)-recettore muscarinico, un recettore accoppiato G(q/11) prototipo. Questo ceppo mutante del mouse &egrave; stato qui utilizzato per indagare il ruolo di M. (3)-fosforilazione del recettore muscarinico nella regolazione della secrezione di insulina da isolotti pancreatici. Soprattutto, il recettore carenti di fosforilazione accoppiato alla G(q/11)-signaling pathways ma fu staccato da processi di fosforilazione-dipendente, come internalizzazione del recettore e &beta;-arrestin reclutamento. I topi knock-in ha mostrato ridotta secrezione insulina e la tolleranza di glucosio, che indica che M (3) - recettori muscarinici espressi su isole pancreatiche regolano l&#39;omeostasi del glucosio tramite la fosforilazione del recettore- / segnalazione arrestin-dipendente. I centri di meccanismo sull&#39;attivazione della chinasi di proteina D1, che opera a valle del reclutamento di &beta;-arrestin fosforilata m (3)-recettore muscarinico. In conclusione, i nostri risultati supportano il concetto unico che M (3) - augmentation mediata dal recettore muscarinico del rilascio di insulina sostenuta &egrave; in gran parte indipendenti da G proteina-accoppiamento ma coinvolge la fosforilazione- / accoppiamento del recettore a chinasi di proteina D1 arrestin-dipendente.

Recettore muscarinico M3 promuove il rilascio di insulina tramite attivazione di recettori fosforilazione/arrestin-dipendente della chinasi di proteina D1.

G &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x5171;&#x5F79;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x306F;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D1;&#x30FC; &#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x6B21;&#x30A2;&#x30B4;&#x30CB;&#x30B9;&#x30C8;&#x523A;&#x6FC0;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x898F;&#x5236;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x898F;&#x5236;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306E;&#x666E;&#x904D;&#x7684;&#x306A;&#x6027;&#x8CEA;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x306E;&#x751F;&#x7406;&#x7684;&#x5F71;&#x97FF;&#x60AA;&#x3044;&#x52C9;&#x5F37;&#x306E;&#x307E;&#x307E;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x554F;&#x984C;&#x306B;&#x5BFE;&#x51E6;&#x3059;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x6B20;&#x640D;&#x5909;&#x7570;&#x4F53; M (3) &#x8868;&#x73FE;&#x3059;&#x308B;&#x30CE;&#x30C3;&#x30AF;&#x30A4;&#x30F3; &#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x7DCA;&#x5F35;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;-&#x30E0;&#x30B9;&#x30AB;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3001;G(q/11) &#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x539F;&#x578B;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x7DCA;&#x5F35;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x3053;&#x3067; M (3) &#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x305F;-&#x30E0;&#x30B9;&#x30AB;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x5206;&#x6CCC;&#x81B5;&#x5CF6;&#x304B;&#x3089;&#x3002;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x306F;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x6B20;&#x4E4F;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53; G(q/11) &#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x7D50;&#x5408;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x5185;&#x5728;&#x5316;&#x3068; &beta; &#x30A2;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C1;&#x30F3;&#x52DF;&#x96C6;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x4F9D;&#x5B58;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x304B;&#x3089;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30CE;&#x30C3;&#x30AF;&#x30A4;&#x30F3; &#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x30B0;&#x30EB;&#x30B3;&#x30FC;&#x30B9;&#x8010;&#x6027;&#x3084;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x306E;&#x5206;&#x6CCC;&#x969C;&#x5BB3;&#x8005; M (3) - &#x81B5;&#x5CF6;&#x306E;&#x30E0;&#x30B9;&#x30AB;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x30B0;&#x30EB;&#x30B3;&#x30FC;&#x30B9;&#x6052;&#x5E38;&#x6027;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;-/&#x30A2;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C1;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E0B;&#x6D41;&#x3067;&#x52D5;&#x4F5C;&#x6A5F;&#x69CB;&#x30FB; &#x30BB;&#x30F3;&#x30BF;&#x30FC;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; D1&#x3001;&beta; &#x30A2;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C1;&#x30F3; &#x30EA;&#x30F3;&#x9178; m &#xFF08;3&#xFF09; &#x306E;&#x52DF;&#x96C6;-&#x30E0;&#x30B9;&#x30AB;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3002;&#x7D50;&#x8AD6;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x8ABF;&#x67FB;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;&#x30E6;&#x30CB;&#x30FC;&#x30AF;&#x306A;&#x30B3;&#x30F3;&#x30BB;&#x30D7;&#x30C8;&#x3092;&#x30B5;&#x30DD;&#x30FC;&#x30C8;&#x305D;&#x306E; M (3) - &#x6301;&#x7D9A;&#x7684;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x5206;&#x6CCC;&#x306E;&#x30E0;&#x30B9;&#x30AB;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x5897;&#x5F37;&#x306E; G &#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x304C;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3067;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x3092;&#x4F34;&#x3044;&#x307E;&#x3059;-/&#x30A2;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C1;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x578B;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; D1 &#x306B;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

M3 &#x30E0;&#x30B9;&#x30AB;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;/&#x30A2;&#x30EC;&#x30B9;&#x30C1;&#x30F3;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30AD;&#x30CA;&#x30FC;&#x30BC; D1 &#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x305F;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x5206;&#x6CCC;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

G &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0;&#xD569; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC758; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC740; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xD558;&#xC774;&#xD37C; &#xB2E4;&#xC74C; &#xAE38; &#xD56D; &#xC81C; &#xC790;&#xADF9;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xD1B5;&#xC81C; &#xB41C;&#xB2E4;. &#xC774; &#xADDC;&#xC81C; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC758; &#xBCF4;&#xD3B8;&#xC801;&#xC778; &#xC131;&#xACA9;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;&#xC758; &#xC0DD;&#xB9AC; &#xC801; &#xC601;&#xD5A5; &#xB0A8;&#xC544; &#xC81C;&#xB300;&#xB85C; &#xACF5;&#xBD80;. &#xC774; &#xBB38;&#xC81C;&#xB97C; &#xD574;&#xACB0; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC6B0;&#xB9AC; M (3)&#xC758; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xBD88;&#xCDA9;&#xBD84; &#xD55C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD45C;&#xD604; &#xD558;&#xB294; &#xB178;&#xD06C; &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4; &#xBCC0;&#xD615; &#xC0DD;&#xC131;-muscarinic &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;, &#xC6D0;&#xD615; G(q/11) &#xACB0;&#xD569; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;. &#xC774; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4; &#xAE34;&#xC7A5; &#xC5EC;&#xAE30; M (3)&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC870;&#xC0AC; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD55C;-&#xC778;&#xC290;&#xB9B0; &#xBD84; &#xBE44; &#xCDCC; &#xC7A5; &#xB3C5;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADDC;&#xC81C;&#xC5D0;&#xC11C; muscarinic &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;. &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAC83;&#xC740;, &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xACB0;&#xD54D; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; G(q/11) &#xC2E0;&#xD638; &#xACBD;&#xB85C;&#xC5D0; &#xACB0;&#xD569; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xAD6D;&#xC81C;&#xD654; &#xBC0F; &beta;-arrestin &#xBAA8;&#xC9D1; &#xB4F1;&#xC758; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xC885;&#xC18D; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xD569; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB178;&#xD06C; &#xC950; &#xBD84; &#xD3EC;&#xB3C4; &#xB2F9; &#xD3EC;&#xC6A9; &#xB825;&#xACFC; &#xC778;&#xC290;&#xB9B0; &#xBE44;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xC7A5;&#xC560;&#xAC00; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0AC;&#xB2E4; M (3)-&#xCDCC; &#xC7A5; &#xB3C5;&#xB3C4; muscarinic &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC758; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xD3EC;&#xB3C4; &#xB2F9; &#xD56D;&#xC0C1;&#xC131; &#xC870;&#xC808;-arrestin &#xC885;&#xC18D; &#xC2E0;&#xD638; /. &#xD558;&#xB958;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; d 1&#xC758; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xC5D0; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xC13C;&#xD130; phosphorylated m (3) &beta;-arrestin&#xC758; &#xBAA8;&#xC9D1;-muscarinic &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;. &#xACB0;&#xB860;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACB0;&#xACFC; &#xC9C0;&#xC6D0; &#xB3C5;&#xD2B9;&#xD55C; &#xAC1C;&#xB150; &#xADF8; M (3)-&#xC9C0;&#xC18D;&#xC801;&#xC778;&#xB41C; &#xC778;&#xC290;&#xB9B0; &#xB9B4;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xC758; muscarinic &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;-&#xC911;&#xC7AC; &#xD655;&#xB300;&#xB294; G &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xACB0;&#xD569; &#xD06C;&#xAC8C; &#xBB34;&#xAD00; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654; &#xD3EC;&#xD568; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;-/ arrestin &#xC885;&#xC18D; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; d 1 &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xC758; &#xCEE4;&#xD50C;&#xB9C1;.

M3 muscarinic &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD0A4; &#xB2C8; &#xC544; &#xC81C; d 1&#xC758; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;/arrestin &#xC885;&#xC18D; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xC218;&#xC6A9; &#xCCB4;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xC778;&#xC290;&#xB9B0; &#xBC29;&#xCD9C; &#xCD09;&#xC9C4;.

La actividad de los receptores acoplados a prote&iacute;nas G se regula mediante la estimulaci&oacute;n de agonista siguientes hiper-fosforilaci&oacute;n. Pese al car&aacute;cter universal de este proceso de reglamentaci&oacute;n, los efectos fisiol&oacute;gicos de la fosforilaci&oacute;n del receptor sigue siendo mal estudiado. Para abordar esta cuesti&oacute;n, hemos generado una cepa de rat&oacute;n knock-in que expresa un mutante de la deficiencia de fosforilaci&oacute;n de la M (3)-receptor muscar&iacute;nico, un prototipo receptor acoplado a G(q/11). Esta cepa de rat&oacute;n mutante fue utilizada aqu&iacute; para investigar el papel de M (3)-fosforilaci&oacute;n de receptores muscar&iacute;nicos en la regulaci&oacute;n de la secreci&oacute;n de insulina de los islotes pancre&aacute;ticos. Lo importante, el receptor deficiente de fosforilaci&oacute;n junto a las v&iacute;as de se&ntilde;alizaci&oacute;n G(q/11) pero fue desacoplado de procesos de fosforilaci&oacute;n dependientes, como internalizaci&oacute;n del receptor &beta;-arrestin reclutamiento. Los ratones knock-in mostraron alteraci&oacute;n de la secreci&oacute;n de insulina y la tolerancia glucosa, lo que indica que M (3) - receptores muscar&iacute;nicos expresados en islotes pancre&aacute;ticos regulan la homeostasis de la glucosa por fosforilaci&oacute;n del receptor- / se&ntilde;alizaci&oacute;n arrestin-dependiente. El mecanismo se centra en la activaci&oacute;n de la prote&iacute;na quinasa D1, que opera en aguas abajo del reclutamiento de &beta;-arrestin fosforilada (m3)-receptor muscar&iacute;nico. En conclusi&oacute;n, nuestros resultados apoyan el concepto &uacute;nico que M (3) - aumento mediada por receptor muscar&iacute;nico de la liberaci&oacute;n de insulina sostenida es en gran parte independiente de G prote&iacute;na-acoplamiento pero implica fosforilaci&oacute;n- / arrestin-dependiente del acoplamiento del receptor a la prote&iacute;na quinasa D1.

Receptor muscar&iacute;nico m3 promueve la secreci&oacute;n de insulina mediante la activaci&oacute;n del receptor de la fosforilaci&oacute;n/arrestin-dependiente de la prote&iacute;na quinasa D1.

Sarah E. Munson

ES Cell Facility,
Centre for Core Biotechnology Services,
ES Cell Facility, Centre for Core Biotechnology Services

University of Leicester

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Sarah E. Munson

ES Cell Facility,Centre for Core Biotechnology Services,ES Cell Facility, Centre for Core Biotechnology Services

University of Leicester

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

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Centre for Core Biotechnology Services,
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